在2025年4月，湖南师范大学的杨荣华教授与邹振副教授带领的团队在《Nucleic Acids Research》（IF=167）上发表了一篇重要研究，题为“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”。此研究创新性地开发了一种基于CRISPR/Cas12a的单核苷酸变异（SNV）检测平台——HEPSD（High-Energetic-Penalty SNV Detection Platform）。

HEPSD系统采用二元crRNA结构设计，可以有效激活Cas12a的切割活性，并通过非平衡杂交技术调节放大单核苷酸错配信号。研究结果表明，HEPSD对极端GC含量下的难以检测的SNV（包括摆动突变）展现出了优异的区分能力，且在临床样本中的检测准确率达到了100%。这进一步证明了HEPSD在临床分子诊断中的潜力，其设计原理也可以扩展至其他CRISPR系统，未来在基因检测领域可能带来重要影响。

研究背景

单核苷酸位点变异（SNVs）是常见的遗传变异形式，和多种严重疾病的发生密切相关，如癌症、单基因疾病及传染病。传统SNV检测方法（如TaqMan探针、分子信标等）在处理难以检测的SNV时效果不佳，特别是在高GC含量区域及摆动碱基对的情况下。CRISPR-Cas系统（如Cas12a）在核酸检测中具有革命性意义，但其在crRNA介导的识别过程中对所有单碱基错配的特异性仍有限。

研究结果

研究中，二元探针结构设计的RNA/DNA结合能力经热力学分析验证，二元探针（BPs）在200℃到-40℃的范围内表现出优越的性能。与线性探针（LPs）相比，BPs能保持长时间结合目标，且在37°C常规温度下保持最佳活性。

基于BP辅助的Cas12a激活性能，研究人员设计了二元CRISPR RNA（crRNA）结构并开发了HEPSD。在分子动力学模拟和荧光各向异性分析中，HEPSD在匹配目标时形成稳定的复合物，而在错配目标时则表现出动态不稳定性，从而有效抑制Cas12a的激活。

HEPSD平台在检测低GC（30%）和高GC（70%）背景下的SNV时，展现出对PAM近端和远端区域的高特异性，检测限制可低至0.01%的突变等位基因频率（VAF）。通过实时荧光实验，HEPSD对完全匹配目标保持高效切割活性，但对错配目标几乎无活性。

临床试验分析

研究团队进一步评估HEPSD在临床样本中的有效性，选择BRAFV600E和EGFRL858R突变作为靶点。在104例BRAFV600E和28例EGFRL858R的临床样本中（包括组织和血浆），HEPSD的敏感性和特异性均达到了100%，与定量PCR（qPCR）和下一代测序（NGS）高度一致。在血浆样本中，结合阻断置换扩增（BDA）技术，HEPSD成功检测到低丰度突变（VAF低至0.01%），优于传统方法。

结论与展望

综上所述，HEPSD平台利用创新的二元crRNA架构，通过非平衡杂交显著放大了碱基错配的能罚差异，实现了超高的特异性识别能力。该平台不仅在传统方法难以检测的SNV方面表现优越，并且在132个临床样本中成功检测到BRAFV600E或EGFRL858R变体，准确率保持在100%。这表明HEPSD在临床分子诊断中展现出巨大的应用潜力，及其在早期癌症诊断和个性化治疗中为患者提供新工具的可能性。此外，HEPSD的平台设计原理也可扩展至其他CRISPR系统，为基因编辑的脱靶控制任务提供了新的思路。

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